دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده علوم و فناوريهاي نوين، گروه زيست شناسي
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد ((M.Sc))
گرايش: سلولي و مولکولي
عنوان:
بررسي نسبت جمعيتي اسپرم‌هاي واجد كروموزم X‌و Y تحت تأثير برخي عوامل محيطي در گونه گاو با استفاده از تكنيك Real-Time PCR
استاد راهنما:
جناب آقاي دکتر فريد حيدري
اساتيد مشاور:
جناب آقاي مهندس احسان هاشمي
سركار خانم دكتر طاهره ناجي
نگارش:
مهديّه صفّاري
شماره پايان نامه: 62 ز س سال تحصيلي93-1392
دانشگاه آزاد اسلامي
واحد علوم دارويي
دانشکده علوم و فناوري هاي نوين
پايان نامه براي دريافت درجه کارشناسي ارشد ((M.Sc))
گرايش: علوم سلولي و مولکولي
عنوان:
بررسي نسبت جمعيتي اسپرم‌هاي واجد كروموزم X‌و Y تحت تأثير برخي عوامل محيطي در گونه گاو با استفاده از تكنيك Real-Time PCR
نگارش:
مهديّه صفّاري
بهمن 1392
هيأت داوران:
1- دکتر امير ميمنديپور
2- دکتر سپيده اربابي
تقديم به :
به پدرم، به مردانه‌ترين دست‌هايي كه تنها بود ولي دستهايم را تنها نگذاشت.
به مادرم، كه آرزوهايش را تنها گذاشت تا دلگرميم باشد.
به هر دوي آنها كه تمام لحظه‌هايشان دلواپس لحظه لحظه‌هايم بودند.
كه نبض احساسشان، تپش اضطراب‌هايم و آرامش شادي و موفقيتم بود.
كه زندگيشان را به پاي من و غم و شاديم دادند.
زندگي و خوشبختي همينجاست:
ميان دو احساس بي‌نظير كه خداوند هديه داده است.
تقديم به شما، شايد كه جبران ذره‌اي از اين بيست و شش سال باشد.
قدرداني:
حال كه توفيق آن را داشته‌ام كه بتوانم گوشه‌اي ناچيز از درياي بزرگ آفرينش را ورق بزنم و مقطع كارشناسي ارشد را با ارائه اين مجموعه به پايان برسانم، ذهن كوچكم جز اين در سطورش مرور نمي‌شود: قدرداني از خوبان.
بدون ترديد تهيه اين پايان‌نامه بدون كمك استاد راهنماي گرانقدرم جناب آقاي دكتر فريد حيدري كه با ايثار ،با صبوري و بخشش و با مهر و محبت آموزگاري، مرا از نور علم و معرفت خويش بهره‌مند ساختند، امكانپذير نبود. از ايشان به خاطر الطاف بزرگ و بي مثالشان قدرداني مي‌كنم.
و سپاس فراوان دارم از جناب آقاي مهندس احسان هاشمي كه مشاوره پايان‌نامه را پذيرفته و از راهنمايي‌هاي خود من را بهره‌مند كردند.
لازم است از سركار خانم دكتر طاهره ناجي و جناب آقاي دكتر مهدي شمس آرا به جهت حمايت و ياري بي منتشان نيز كمال تشكر را به جا آورم.
و در آخر سپاس دارم از پدر و مادر و خواهر عزيزم و دوستان بزرگوارم ،جناب آقاي احسان جهانگيريان ،سرکار خانم مارال طاووسي و خانمها فاطمه فرزانه ، زهره ميرزاپور و پروين ولي الّهي كه هميشه در کنارم بودند و تنهايم نگذاشتند.
فهرست مطالب
عنوان صفحه
چكيده فارسي 1
مقدمه 2
فصل اول: كليات
پيشگفتار 4
1-1- آناتومي دستگاه تناسلي دام نر 5

1-1-1- اسپرماتيك كورد (بند بيضه) 6
1-1-2- اسكروتوم(كيسه بيضه) 6
1-1-2-1- ماهيچه دارتوس 7
1-1-2-2- تونيكا واژنياليس 7
1-1-3- بيضه‌ها 8
1-1-4- اپيديديم 10
1-1-5- غدد ضميمه تناسلي 12
1-1-5-1 آمپولا 12
1-1-5-2- وزيكول سمينال 12
1-1-5-3- پروستات 13
1-1-5-4- غدد كوپر 13
1-1-6- آلت تناسلي نر 14
1-2- فيزيولوژي دستگاه تناسلي دام نر 15
1-2-1- اسپرماتوژنز 15
1-2-1-1- اسپرماتوسيتوژنز 15
1-2-1-2- اسپرميوژنز 15
1-2-1-3- روند كلي اسپرماتوژنز 16
1-2-2- اسپرم 20
1-2-3- مايع مني 21
1-3- نسبت جنسي 21
1-3-1- مقدمه 21
1-3-2- ژنتيك دام نر 22
1-3-3- تفاوت اسپرم‌هاي واجد كروموزوم X و Y 23
1-3-4- تعريف نسبت جنسي 25
1-3-5- اهميت كنترل نسبت جنسي 26
1-3-6- عوامل موثر بر انحراف نسبت جنسي 27
1-3-6-1- عوامل ژنتيكي و فيزيولوژيكي 27
1-3-6-2- عوامل محيطي 28
1-3-7- روش‌هاي تعيين نسبت جنسي اسپرم 28
1-4- واکنش زنجيرهاي پليمراز کيفي( PCR) 29
1-5- واکنش زنجيرهاي پليمرازکمّي((Real-Time PCR 31
1-5-1- تعريف واکنش (Real-Time PCR) 31
1-5-2- مزاياي واکنش Real-Time PCR 31
1-5-3- مراحل اصلي واکنش Real-Time PCR 32
1-5-4- روشهاي انجام واکنش Real-Time PCR 32
1-5-4-1- قالب غير اختصاصي Nonspecific Format 32
1-5-4-2- قالب اختصاصي Specific Format 34
1-5-4-2-1- شناساگرهاي دوسويه نشاندار يا شناساگرهاي TaqMan 35
1-5-4-2-2- شناساگرهاي بيکون مولکولي 37
1-5-4-2-3- سيستم شناساگر FRET 38
1-5-4-2-4- شناساگرهاي عقربي 39
1-5-4-2-5- ساير سيستمها 40
1-5-5- برخي مفاهيم و اصطلاحات در تکنيک Real-Time PCR 41
1-5-5-1- منحني تکثير 41
1-5-5-2- گزارشگر نرمالشده((Rn 43
1-5-5-3- چرخه آستانه( (CT 44
1-5-5-4- منحني ذوب 45
1-5-5-5- منحني استاندارد 47
1-5-6- آناليز داده‌هاي کمي 49
فصل دوم: مروري بر متون گذشته
2-1- مطالعات پيرامون نسبت جنسي 51
2-2- مطالعات روي روشهاي تعيين نسبت جنسي 53
فصل سوم: مواد و روشها
3-1- زمان و محل انجام تحقيق 58
3-2- مراحل انجام کار 58
3-2-1- تهيه اسپرم 58
3-2-2- استخراج DNA از سلولهاي اسپرم 59
3-2-2-1- مواد و لوازم استخراج DNA 59
3-2-2-2- روش کار براي استخراج DNA 60
3-2-2-2-1- شستشوي اسپرم 60
3-2-2-2-1-1- ساخت محلول PBS 60
3-2-2-2-1-2- شستشو 61
3-2-2-2-2- پروتئينزدايي 62
3-2-2-2-2-1- ساخت محلول Lysis Buffer 62
3-2-2-2-2-2- رسوب پروتئينها 62
3-2-2-2-3- جداسازي DNA 63
3-2-2-2-4- تعيين غلظت DNA 64
3-2-2-2-4-1- استفاده از ژل آگارز 64
3-2-2-2-4-1-1- مواد و لوازم ساخت ژل آگارز 64
3-2-2-2-4-1-2- روش کار با ژل آگارز 65
3-2-2-2-4-2– استفاده از دستگاه اسپکتروفوتومترِ نانودراپ 66
3-2-3- واکنش PCR کيفي 66
3-2-3-1- هدف از واکنش PCR کيفي 66
3-2-3-2- مواد و لوازم براي واکنش PCR کيفي 66
3-2-3-3- روش انجام واکنش PCR کيفي 67
3-2-3-3-1- طراحي آغازگر 67
3-2-3-3-2- رقيقسازي آغازگرها 68
3-2-3-3-3- محاسبه مقادير واکنشPCR کيفي 69
3-2-3-3-4- تعيين شرايط واکنشPCR کيفي 70
3-2-3-3-5- آمادهسازي مخلوط واکنشPCR کيفي 70
3-2-3-3-6- الکتروفورز محصولات PCR کيفي 71
3-2-4- واکنش Real-Time PCR 71
3-2-4-1- – هدف از انجام واکنش Real-Time PCR 71
3-2-4-2- مواد و لوازم براي واکنش Real-Time PCR 71
3-2-4-3- روش انجام واکنش Real-Time PCR 72
3-2-4-3-1- رقيقسازي آغازگرها 72
3-2-4-3-2- محاسبه مقادير در واکنش Real-Time PCR 73
3-2-4-3-3- تعيين شرايط دمايي و زماني واکنش Real-Time PCR 73
3-2-4-3-4- رسم منحني استاندارد از طريق واکنش Real-Time PCR 74
3-2-4-3-5- بررسي CT و TM از طريق واکنش Real-Time PCR 74
3-2-4-3-6- آمادهسازي مخلوط واکنش Real-Time PCR 76
3-2-4-3-7- آناليز دادههاي واکنش Real-Time PCR 76
فصل چهارم : نتايج
4-1- نتايج استخراج DNA 78
4-1-1- نتيجه الکتروفورز محصولات استخراجDNA. 78
4-1-2- نتيجه غلظتخواني با دستگاه نانودراپ 79
4-2- نتيجه الکتروفورز محصولات PCR. 80
4-3- نتايج حاصل از Real-Time PCR.. 82
4-3-1- منحني استاندارد……………………………………………………………………………………. 82
4-3-2- منحني ذوب و محاسبه TM…………………………………………………………………… 83
4-3-3- منحني تکثير و محاسبه CT…………………………………………………………………. .87
4-3-4- نتيجه الکتروفورز محصولات Real-Time PCR……………………………………….. .90
4-3-5- آناليز کمّي دادهها………………………………………………………………………………….. 94
فصل پنجم : بحث وپيشنهادات
5-1- بحث ………………………………………………………………………………………………. .99
5-2- پيشنهادات……………………………………………………………………………………. 102
منابع 103
چکيده انگليسي 106
ضمايم 108
فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول(3-1):شماره ثبت شده دام روي پايوتهاي محتوي مايع مني………………………………….. 58
جدول(3-2): مواد تشکيل دهنده محلول PBS ………………………………………………………… 60
جدول(3-3): مواد تشکيل دهنده محلول Lysis Buffer ……………………………………………. 62
جدول(3-4): اطلاعات مربوط به آغازگرها ……………………………………………………………….. 68
جدول(3-5): مقادير مواد واکنش PCR ………………………………………………………………… 69
جدول(3-6): شرايط دمايي و زماني واکنش PCR ……………………………………………………. 70
جدول(3-7): مقادير مواد واکنش PCR ………………………………………………………………… 73
جدول(3-8): شرايط دمايي و زماني واکنش PCR Real-Time ………………………………….. 74
جدول (4-1):غلظت DNA ( ng.µl-1 ) براي 7 رأس گاو در فصل سرد…………………………….. 79
جدول (4-2): غلظت DNA ( ng.µl-1 ) براي 7 رأس گاو در فصل گرم…………………………….. 79
جدول (4-3) : محاسبه ميانگين عدد CT بين دو تکرار در هر نمونه…………………………………. 95
جدول (4-6) : عدد مقياس مطلق(تفاوت عدد الگوي اوليه ژن SRY و PLP ……………………. ………………97
فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل (1-1) : اسپرماتيک کورد(بند بيضه) …………………………………………………………… 6
شکل (1-2) : اسکروتوم (کيسه بيضه) ………………………………………………………………… 7
شکل (1-3) : بيضه ها در گاو …………………………………………………………………………. 8
شکل (1-4) : بيضه ها ولوله هاي اسپرم ساز و شبکه رته تستيس ………………………………… 10
شکل (1-5) : اپيديديم ………………………………………………………………………………… 11
شکل (1-6) : غدد ضميمه تناسلي …………………………………………………………………… 13
شکل (1-7) : آلت تناسلي گاو نر ……………………………………………………………………. 14
شکل (1-8) : اسپرماتوژنز ……………………………………………………………………………… 16
شکل (1-9) : اسپرماتوژنز و هورمونها ………………………………………………………………. 17
شکل (1-10) : مراحل سلولي اسپرماتوژنز …………………………………………………………… 19
شکل (1-11) : اسپرم …………………………………………………………………………………. 20
شکل (1-12) : کاريوتيپ گاو ………………………………………………………………………… 22
شکل (1-13) : اسپرم واجد کروموزوم Y و X ……………………………………………………… 24
شکل( 1-14) : مکانيسم عمل رنگ SYBR-Green طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)……33
شکل( 1-15) : مکانيسم عمل شناساگرهاي دوسويه نشاندار يا شناساگرهاي TaqMan ………………..36
شکل( 1-16) : مکانيسم عمل شناساگرهاي بيکون مولکولي طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)………. 37
شکل( 1-17) : مکانيسم عمل شناساگر FRET طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR) ……… 38
شکل( 1-18) : مکانيسم عمل شناساگر عقربي طي واکنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)………….. 40
شکل (1-19) : منحني تکثير در واکنش Real-Time PCR ………………………………….. 42
شکل (1-20) : رنگ مرجع خنثي) (ROX ……………………………………………………… 43
شکل (1-21) : منحني تکثير و نمايش CT ………………………………………………………. 44
شکل (1-22) : منحني ذوب و Tm ………………………………………………………………… 46
شکل (1-23) : منحني استاندارد ……………………………………………………………………. 48
شکل(3-1):پايوتهاي محتوي مايع مني …………………………………………………………… 58
شکل (4-1) : نتايج حاصل از استخراج DNA …………………………………………………… 78
شکل( 4-2 ): نتايج حاصل از PCR ……………………………………………………………….. 81
شکل (4-3) : منحني استاندارد …………………………………………………………………….. 82
شکل( 4-6 ): منحني ذوب و ميزان Tm محاسبهشده براي آغازگر SRY در فصل گرم …….. 84
شکل( 4-7 ): منحني ذوب و ميزان Tm محاسبهشده براي آغازگر SRY در فصل سرد ……. 84
شکل( 4-8 ): منحني ذوب و ميزان Tm محاسبهشده براي آغازگر PLP در فصل گرم ……. 85
شکل( 4-9 ): منحني ذوب و ميزان Tm محاسبهشده براي آغازگر PLP در فصل سرد ……. 85
شکل( 4-10 ): منحني ذوب و ميزان Tm محاسبهشده براي آغازگر PARدر فصل گرم……. 86
شکل( 4-11 ): منحني ذوب و ميزان Tm محاسبهشده براي آغازگر PARدر فصل سرد……. 86
شکل( 4-12 ): منحني تکثير و ميزان CT مربوطه براي آغازگر SRY در فصل گرم ………….87
شکل( 4-13 ): منحني تکثير و ميزان CT مربوطه براي آغازگر SRY در فصل سرد………… 87
شکل( 4-14 ): منحني تکثير و ميزان CT مربوطه براي آغازگر PLP در فصل گرم ………… 88
شکل( 4-15 ): منحني تکثير و ميزان CT مربوطه براي آغازگر PLP در فصل سرد ………… 88
شکل( 4-16 ): منحني تکثير و ميزان CT مربوطه براي آغازگر PAR در فصل گرم………… 89
شکل( 4-17 ): منحني تکثير و ميزان CT مربوطه براي آغازگر PAR در فصل سرد ………. 89
شکل( 4-18 ) : نتيجه واکنش qPCR براي آغازگر SRY …………………………………. 91
شکل (4 – 19): نتيجه واکنش qPCR براي آغازگر SRY …………………………………… 91
شکل(4-20) : نتيجه واکنش qPCR براي آغازگر PLP ………………………………………. 92
شکل(4-21) : نتيجه واکنش qPCR براي آغازگر PLP ……………………………………..92
شکل(4-22) : نتيجه واکنش qPCR براي آغازگر …………………………………….PAR 93
شکل(4-23) : : نتيجه واکنش qPCR براي آغازگر …………………………………PAR…… 93
شکل (4-24) : فرمولهاي محاسبه و آناليز کمّي آزمايش …………………………………….. 96
چکيده فارسي:
جنسيت مواليد در صنعت دامپروري و از نظر اقتصادي بسيار حائز اهميت است.افزايش بهرهوري اقتصادي و نيز کنترل بيماريهاي ژنتيکي وابسته به جنس ارتباط مستقيمي با جنسيت مواليد دارد.نسبت جنسي مواليد اتفاقي نبوده و عوامل مختلفي در تعيين جنسيت مواليد نقش دارد.يکي از اين عوامل،نسبت جنسيتي اسپرمهاي واجد کروموزوم X و Y در انزالِ طبيعي است. مهم‌ترين عوامل محيطي که احتمال مي‌رود روي اين نسبت تاثير داشته باشد،استرس گرماييو تفاوت‌هاي فردي مي‌باشد. در مطالعه حاضر به بررسي تغيير نسبت جمعيتي اسپرم‌هاي واجد کروموزوم Y به اسپرم‌هاي واجد کروموزومX در انزال گاو نر تحت تاثير تنش گرمايي و بررسي تفاوت‌هاي فردي با استفاده از تکنيک Real-Time PCR پرداخته شد. به اين منظور از 7 رأس گاو نر بالغ در دو فصل گرم (تحت تأثير استرس گرمايي) و سرد نمونهگيري به عمل آمد و پس از استخراج محتوي ژنتيکي، با استفاده از سه جفت آغازگر ژنهاي SRY (شاخص کروموزوم Y)،PLP (شاخص کروموزوم X ) و PAR (ژن خانهدار)و با استفاده از روش Q-PCR مورد ارزيابي کمي قرار گرفتند.نتايج اين تحقيق نشان داد که نسبت جمعيتي کروموزومهاي واجد X و Y در انزال طبيعي در ميان دامها يکسان نيست.همچنين نشان داد که تنش گرمايي با افزايش نسبت جمعيتي کروموزومهاي Y رابطه دارد.کلمات کليدي: نسبت جنسي، اسپرم، استرس گرمايي، تفاوت فردي، Real-Time PCR
مقدمه
امروزه در جهت توسعه صنعت دامپروري در راستايبهبود اقتصادي، بهبود ژنتيکي و سلامت دام،يکي از بهترين راهها کنترل جنس مواليد و نسبت جنسي است. يکي از بهترين راه‌ها براي بررسي نسبت جنسي مواليد و کنترل آن تعيين جنسيت اسپرم‌ها و نسبت آنها است. اين نسبت تحت تأثير عوامل مختلفي از جمله عوامل محيطي و ژنتيکي است. مهم‌ترين عواملي که ممکن است بر اين نسبت تأثير معني‌داري داشته باشد، استرس گرمايي1 و تفاوت‌هاي فردي مي‌باشد.
به اين منظور مطالعه حاضر به بررسي نسبت جمعيتي اسپرم‌هاي واجد کروموزوم Y به اسپرم‌هاي واجد کروموزوم X در انزال گاو در دامهاي مختلف و تحت تاثير تنش گرمايي با استفاده از تکنيک Real-Time PCR مي‌پردازد.
در اين آزمايش از روش Real-Time PCR با ماده شناساگر SYBR Green و ارزيابي نسبي استفاده شد. به همين جهت 3 آغازگر (Primer) تحت عنوان SRY (شاخصه کروموزوم(YPlP(شاخصه کروموزوم X) و PAR (به عنوان ژن خانه‌دار2) که کنترل داخلي محسوب مي‌شود،طراحي شد.
فصل اول
کليات
پيشگفتار:
نسبت جنسي مواليد يک شاخص سرشماري مهم است که از اواخر قرن هفدهم مورد بررسي قرار گرفته است. اگر بتوانيم اين نسبت را کنترل کنيم يا نتايج نسبت جنسي را تغيير دهيم براي اصلاح نژاد دام در صنعت دامپروري و از نظر اقتصادي بسيار مفيد خواهد بود. تئوري نسبت جنسي و توضيح علل و مکانيسم‌هاي آن هنوز موضوعي قابل بحث است[28 ، 27].
در صنعتپرورش گاو گوشتي توليد گوشت بدون چربي بر پايه توليد گوساله نر مي‌باشد.اما در صنعت گاو شيري توليد گوساله ماده به منظور حفظ گله حائز اهميت است. بنابراين کنترل نسبت جنسي در حيوانات جايگاه بالايي در برقراري تعادل نسبت به نرها و ماده‌ها در گونه‌هاي در حال انقراض،تسريع روند اصلاح ژنتيکي دام‌ها،تسهيل مديريت دامپروري و بهره‌هاي فراوان در دامپروري دارد[27, 3].
در پستانداران در جنس ماده دو کروموزومجنسي مشابه (XX) حضور دارد امادر موجود نر به جهت دارا بودن دو کروموزوم جنسي متفاوت (XY) معين‌کننده جنس فرزند است[11, 10].
پس اگر بتوانيم عوامل موثر بر تغير نسبت جنسيت اسپرم‌ها (حاوي X و يا Y بودن) را بررسي کنيم و اين عوامل را کنترل کنيم،در واقع ميتوانيم نسبت جنسي را تحت کنترل بگيريم. ديده شده است که عوامل گوناگوني از جمله محيط و وراثت مي‌توانند روي جنسيت اسپرم‌ها موثر باشند. يعني اينکه منجر به اين امر مي‌شود که نسبت جنسي اسپرم‌ها در انزال که به طور تئوري 1:1 است اما در عمل اينگونه نيست را دستخوش تغيير کند[31, 27, 8].
بررسي نسبت جمعيتي اسپرم‌هاي واجد کروموزوم X به اسپرم‌هاي واجد کروموزوم Y با استفاده از روش‌هايي نظير فلوسيتومتري،PCR، Real-Time PCR و FISH انجام مي‌گيرد[31،25، 17].
بدين منظور در اين پايان‌نامه برآنيم که
اثر دو عامل تنش گرمايي و تفاوت‌هاي فردي را روي تغيير نسبت جنسي اسپرم‌ها از 1:1 به مقداري متفاوت با استفاده از تکنيک Real-Time PCR بررسي کنيم.
پيش‌بيني ما اين است که اولاً در فصل گرما و در تنش گرمايي تعداد اسپرم‌هاي واجد کروموزوم Y نسبت به اسپرم‌هاي واجد کروموزوم Xدر انزال گاوها بيشتر است و ثانياً اين نسبت در گاوهاي متفاوت با هم فرق دارد(تفاوت فردي)،در اين تحقيق بررسي ما بر روي مايع مني 8 گاو است که يک بار در فصل گرما و يک بار در فصل سرما در آنها انزال صورت گرفته است،مي‌باشد.
1-1- آناتومي دستگاه تناسلي دام نر
(Male Reproductive Anatomy)
بخش‌هاي اساسي دستگاه توليدمثل دام نر شامل اسپرماتيک کورد3 (بند بيضه)،اسکلروتوم4 (کيسه بيضه)،بيضه5،اپيديديم6،غدد ضميمه تناسلي7،آلت تناسلي8 مي‌باشد[42, 37]، که به اقتضاي پايان‌نامه به اختصار به هر يک اشاره خواهد شد.
1-1-1- اسپرماتيک کورد (بند بيضه)
ساختاري طنابي شکل در جنس نر که توسط مجاري دفران9 و بافت‌هاي اطراف آن شکل گرفته است و از سمت شکم به هر بيضه مي‌رسد و شامل انواع سرخرگ‌ها10، اعصاب مختلف11، شبکه پمپيني فورم12، عروق لمفاتيک13و عضله کرماستر14 و … است[42، 37، 1].
1-1-2- اسکروتوم (کيسه بيضه)
در بسياري از پستانداران از جمله گاوها، بيضه‌ها در حفره‌اي،بيرون از بدن قرار دارند که به آن اسکروتوم يا همان کيسه بيضه گفته مي‌شود. در واقع اين کيسه با يک ديواره به دو حفره تقسيم مي‌شود و هر يک از بيضه‌ها در يکي از اين حفرات قرار مي‌گيرند.
ديواره اسکروتوم شامل پوست رويي (ادامه پوست شکم)، ماهيچه‌اي به نام دارتوس15 و بخشي به نام تونيکا واژيناليس16 است. نقش اين کيسه حفاظت از بيضه‌ها و تنظيم دماي مناسب براي عملکرد آنهاست. چرا که توليد اسپرم در بيضه‌ها حدود 7-4 درجه پايين‌تر از دماي بدن رخ مي‌دهد[42, 1].
1-1-2-1- ماهيچه دارتوس
لايه‌اي است ماهيچه‌اي که در زير پوست کيسه بيضه قرار دارد و با انقباض و انبساط خود،باعث مي‌شود تا بيضه‌ها در هواي گرم به طرف خارج از بدن و در هواي سرد به طرف داخل بدن براي تنظيم درجه حرارت بيضه‌ها،کشيده شوند. اين عضله غير ارادي بوده و در ديواره بين دو نيمه راست و چپ اسکروتوم کشيده شده است[42, 1].
1-1-2-2- تونيکا واژيناليس
يک شبکه خوني که بيضه‌ها را پوشانده است. در واقع کيسه‌اي است از غشاي حاوي سرم و حالت آبکي دارد. کنار قدامي به سطوح داخلي و خارجي هر بيضه را مي‌پوشاند[37].
1-1-3- بيضه‌ها
بيضه‌ها در گاو بيضي شکل مي‌باشند. طول آنها حدود 15-10 سانتي‌متر و عرض آنها حدود 8-5 سانتي‌متر است. اين بيضه‌ها حدود 500-400 گرم وزن دارند. بيضه‌ها توسط طناب‌هاي اسپرماتيک در اسکروتوم معلق (آويزان) مي‌باشند.
اين اندام داراي دو وظيفه اصلي است:
1- توليد اسپرم
2- توليد هورمون‌هاي جنسي نر (آندروژن‌ها)17
هر بيضه داخل يک بافت پيوندي سفيد رنگي به نام تونيکا آلبوژينا18 است که خود توسط تونيکا واژيناليس پوشيده شده است و در قسمت کنار خلفي بيضه، به صورت يکتورفتگي عمودي و ناقص و ضخيم درمي‌آيد که به آن ناف يا مدياستينوم بيضه19 گفته مي‌شود و عروق و مجاري بيضه از اين قسمت وارد بيضه مي‌شوند.تعداد زيادي سپتوم ناقص (ترابکول) از مدياستينوم بيضه به درون آن نفوذ کرده و در نهايت داخل بيضه را به حدود 300-200 لوبول هرمي شکل تقسيم مي‌کند.
هر لوبول حاوي 3-2 عدد لوله اسپرم‌ساز20 پر پيچ و خم و بخشي به نام بافت بينابيني مي‌باشد. در واقع لوله‌هاي اسپرم‌ساز حاصل نفوذ بخشي از کپسول به داخل بافت بيضه‌ها مي‌باشند و حدود 70 تا 90 درصد وزن بيضه‌ها را تشکيل مي‌دهند. انتهاي لوله‌هاي اسپرم‌ساز در راس لوبول‌ها به صورت لوله مستقيم به هم مي‌رسند و سپس وارد مدياستينوم بيضه مي‌شود. در مدياستينوم بيضه،اين لوله‌ها با هم پيوند (آناستوموز) شده و شبکه بيضه‌اي به نام رته تستيس21 را تشکيل مي‌دهند(در مرکز بيضه) [42, 1].
سلول‌هاي توليدکننده اسپرم (اسپرماتوگونيا) در سرتاسر غشاي پايه لوله‌هاي اسپرم‌ساز قرار گرفته‌اند و توسط سلول‌هاي سرتولي محافظت مي‌شوند.
همانطور که سلول‌هاي اسپرمي تقسيم و بالغ مي‌شوند از سمت غشا به لومن در لوله‌هاي اسپرم‌ساز جابجا مي‌شوند و سپس به شبکه رته‌تستيس در مرکز بيضه منتقل مي‌شوند تا به مجاري افران و سپس دفران برده شوند و از آنجا به اپيديديم بروند.
بافت بينابيني دربرگيرنده عروق خوني،اعصاب و يک سري سلول‌هاي متمايز شده به نام سلول‌هاي لايديگ22 مي‌باشند که هورمون‌هاي جنسي توليد مي‌کنند که به خون و سلول‌هاي سرتولي منتقل مي‌شوند[15].
1-1-4- اپيديديم
اپيديديم ساختاري فشرده و پهني است که در اتصال و نزديکي يک سمت بيضه کشيده شده است. اين لوله درهم پيچيده داراي 3 قسمت سر23، تنه24 و دم25 مي‌باشد.
درون اين لوله، حدود 160-130 توبول وجود دارد که نهايتاً به يک لوله به نام وازودفران26 ختم مي‌شوند.
حدوداً 45 تا 50 روز زمان لازم است تا اسپرم‌ها در لوله‌هاي اسپرم‌ساز شکل بگيرند و به اپيديديم وارد شوند و در آنجا بالغ و آماده براي انزال27 شوند[15].
حدود يک هفته از زمان گفته شده در اپيديديم سپري مي‌شود تا اسپرم‌ها به اسپرم‌هاي بالغ و بارور تبديل گردند[42, 15].
اسپرم‌ها که در اپيديديم ذخيره شده‌اند،نسبت به آن دسته که تازه وارد آن شدند و به عبارتي اخيراً شکل گرفته‌اند،به تنش‌هاي گرمايي مقاوم‌تراند.
در مدت زمان 45 تا 50 روز که اسپرم‌ها در حال ساخته شدن هستند. قدرت باروري موجود نر کاهش خواهد داشت اما بعد از آن قدرت آن بسيار زياد خواهد شد.
از آنجايي که اپيديديم تنها مجراي خروجي اسپرم‌هاي توليد شده در بيضه مي‌باشد،هرگونه انسداد آن اهميت ويژه‌اي خواهد داشت. گاهي يک انسداد موقت که ايجاد تورم مي‌کند. مي‌تواند منجر به آسيب و عفونت گردد و نهايتاً عبور اسپرم‌ها را از اين لوله مسئله‌ساز کند[42].
1-1-5- غدد ضميمه تناسلي
اين غدد در امتداد ميزراه لگني28 قرار گرفته‌اند. وظيفه آنها توليد مايعي است که وارد مجراي تناسلي شده و با اسپرماتوزوآ مخلوط مي‌گردد و تشکيل مايع مني29 را مي‌دهد.
اين غدد شامل آمپولا،وزيکول سمينال30،پروستات31 و غدد کوپر32 مي‌باشد[37, 1].
1-1-5-1- آمپولا
در قسمت انتهايي مجراي و ابران قرار گرفته است و کار آن ذخيره اسپرماتوئيد و دخالت در تشکيل پلاسماي مايع مني است[37].
1-1-5-2- وزيکول سمينال
اين غده در گاو حالت سفت و لوبوله دارد و در نزديکي آمبولا در کف لگن قرار گرفته است. اين غده داراي دو بخش است که طول هر يک 5-4 سانتي‌متر مي‌باشد و هر کدام از طريق يک مجرا به ميزراه مي‌ريزند.ترشحات آن آبکي و شفاف است و مواد مغذي و بافري براي مني را فراهم مي‌کند[42, 37].
1-1-5-3- پروستات
اين غده در بخش گردن مثانه در کف لگن قرار گرفته است و به پيشابراه لگني مربوط مي‌شود. اين غده ترشحاتش را به هنگام انزال به مني اضافه مي‌کند. در گاو رشد کمي دارد و حجم ترشحاتش کم است[42, 37].
1-1-5-4- کوپر
يک جفت غده هستند که به صورت پشتي در پيشابراه لگني کشيده شده‌اند. محکم و کوچک هستند و يکي از اعمال مهم ترشحات اين غدد اين است که ميزراه را از باقي‌مانده ادرار که براي اسپرم‌ها مضر است،پاک مي‌کند. اين ترشحات معمولاً از آلت تناسلي در طول تحريکات جنسي بيرون مي‌چکد[42, 37].
عفونت يکي از غدد ضميمه باعث مي‌شود رنگ مايع مني زرد يا تيره شود که علت آن وجود چرک و سلول‌هاي فاسد است. در گاو عفونت وزيکول سمينال شايع است.
1-1-6- آلت تناسلي نر
عضو مربوط به جفت‌گيري (مقاربت جنسي)33 است. در درون اين عضو در همه حيوانات اهلي دو لوله استوانه‌اي تو خالي و غار مانند وجود دارد که به هنگام تحريکات جنسي اين فضا پر از خون مي‌شود و در نتيجه اين رخداد،نعوظ34 ايجاد مي‌شود. گلنز35 مربوط به انتهاي پنيس است که حاوي عصب‌هاي زيادي است که براي جفت‌گيري لازم هستند[42].
1-2- فيزيولوژي توليد مثل دام نر
Physiology)(Male Reproductive
1-2-1- اسپرماتوژنز36
فرآيند اصلي توليدمثل دام نر اسپرماتوژنر نام دارد و شامل مراحل اسپرماتوسيتوژنز37 و اسپرميوژنز38 مي‌باشد که نهايتاً توليد سلول‌هاي اسپرماتوزوآ از اسپرماتوگوني را منجر مي‌شود. در گاو اين مراحل به طور کلي نيازمند 60 تا 70 روز کامل مي‌باشد. گاو نر طبيعي به ازاي هر گرم از بافت بيضه بين 17-12 ميليون اسپرم مي‌سازد[37].در واقع اين پروسه،يک پروسه طولاني است که سلول‌هاي اسپرماتوگوني يک سري با تقسيمات ميتوز و ميوز به سلول‌هاي هاپلوئيدي اسپرماتوزوآ تبديل مي‌شوند. اين روند نيازمند بيان و ازدياد برخي از ژن‌هاست.اسپرماتوژنر موفق نيازمند رشد و نمو طبيعي بيضه‌ها و لوله و مجاري مرتبط با آن است[24].
1-2-1-1- اسپرماتوسيتوژنز
روند تبديل سلول‌هاي اسپرماتوگونيا به اسپرماتيد که در بيضه‌ها صورت مي‌گيرد و عمده اين روند تحت اثر هورمون FSH39 که از هيپوفيز قدامي40 ترشح مي‌شود، مي‌باشد[37, 24].
1-2-1-2- اسپرميوژنز
روند تبديل اسپرماتيد41 به اسپرماتوزوئيد42 که در بيضه‌ها صورت مي‌گيرد و عمده اين روند تحت اثر هورمون FSH که از هيپوفيز قداميو سلول‌هاي ليديگ ترشح مي‌شود،مي‌باشد[37, 24].
1-2-1-3- روند کلي اسپرماتوژنز
قبل از انزال،سلول‌هايي که بعداً به اسپرم بالغ تبديل مي‌شوند،به ترتيب به شبکه رته تستيس،مجاري وابران،اپي ديديم،وازودفران و لوله انزال و نهايتاً مجراي ميزراه مي‌روند[24].
از طرفي عملکرد طبيعي دستگاه توليدمثلي در دام نر عمدتاً توسط هورمون‌ها کنترل مي‌شود. عملکرد بيضه‌ها به عنوان يک غده باعث توليد هورمون‌هاي مردانه از جمله تستوسترون43 مي‌شود[15].
در گاو در 4 ماهگي از غده هيپوتالاموس GnRH44 توليد مي‌شود. اين هورمون روي غده هيپوفيز قدامي تاثير گذاشته و منجر به توليد هورمون‌هاي LH و FSH از آن مي‌گردد. هورمون LH روي سلول‌هاي ليديگ که در بافت بينابيني بيضه قرار دارند اثر گذاشته و منجر به توليد هورمون تستوسترون از اين سلول‌ها مي‌شوند که اين هورمون به خون و سلول‌هايي به نام سرتولي که حضور آنها در دوران جنيني براي نمو بيضه و در دوران بلوغ براي روند اسپرماتوژنز لازم است، منتقل مي‌شود[11, 13, 14]. هورمون FSH روي سلول‌هاي سرتولي با کمک تستوسترون رسيده از سلول‌هاي ليديگ اثر گذاشته و منجر به انجام اسپرماتوژنز مي‌شود[42, 24].
اين هورمون‌ها توسط مکانيسم‌هاي فيدبکي کنترل مي‌شوند و در ارتباط تنگاتنگي با هم هستند. عملکرد طبيعي آنها بسته به تعادل در ميزان آنهاست.
هورمون FSH و تستوسترون با افزايش سطح cAMP، افزايش ساخت پروتئين‌ها و افزايش توليد استراديول‌ها در سلول‌هاي سرتولي باعث روند اسپرماتوژنز مي‌شوند[15].
-در هنگام بلوغ،اسپرماتوگوني بنيادي با انجام تقسيم ميتوز هم مي‌تواند اسپرماتوگوني تيپ A را ايجاد کند و هم به جهت آن که سلول بنيادي است،مي‌تواند خود را بسازد45.
اسپرماتوگوني تيپ A چهار با تقسيم ميتوز مي‌کند. بار اول سلول‌هاي واسط46 را توليد مي‌کند و بار دوم و سوم اسپرماتوگوني تيپ B را ايجاد مي‌کند و بار چهارم اسپرماتوسيت اوليه47 ايجاد مي‌شود. اين روند 15 روز در گاو طول مي‌کشد.
اسپرماتوسيت اوليه در 6-4 ماهگي در لوله‌هاي اسپرم‌ساز ديده مي‌شود و با انجام تقسيم اوليه ميوز48به اسپرماتوسيت ثانويه49 تبديل مي‌شوند. اين مرحله نيز 15 روز طول مي‌کشد.
اسپرماتوسيت ثانويه در طي 2-1 روز با انجام ميوز دوم به اسپرماتيد تبديل مي‌شود.
اسپرماتيد يک هسته کروي دارد که به وسيله سيتوپلاسم حاوي مقادير زيادي ميتوکندري و جسم گلژي احاطه شده است. اين سلول در 7-6 ماهگي در لوله‌هاي اسپرم‌ساز گاو ديده مي‌شود. اين اسپرماتيد بايد به اسپرماتيد ثانويه تبديل شود. سپس اين سلول با از دست دادن قسمت اعظم سيتوپلاسم خود و تغييرات مورفولوژيکي و محتوايي طي اسپرميوژنز به اسپرماتوزوآ تغيير مي‌کند که تبديل اسپرماتيد به اسپرماتوزوآ که همان اسپرم بالغ است. حدود 36 روز طول مي‌کشد. در مجموع کل اين فرآيند در گاو نر نيازمند 70-65 روز کامل مي‌باشد[24, 16].
1-2-2- اسپرم
– اسپرم سلولي است تخصص يافته است که براي انجام عمل منحصر به فرد باروري اووسيت‌ها50، تمايز پيدا کرده است. اساس ساختماني آن در حيوانات اهلي تقريباً شبيه هم است. فقط در اندازه و شکل کمي متفاوت است. اسپرم داراي چهار بخش سر،گردن و قطعه مياني و دم است.بخش قدامي سر اسپرم که توسط کپسول آکروزومي پوشيده شده است،حاوي آنزيم براي هضم ديواره تخمک است.گردن اسپرم حاوي دو سانتريول است و بين سر و قطعه مياني قرار گرفته است.قطعه مياني، ميتوکندري را دارا مي‌باشد که انرژي لازم براي حرکت و اعمال متابوليکي را برعهده دارد[11]. دم،يک آکسون مرکزي دارد که توانايي تحرک به اسپرم مي‌دهد[37, 1].
1-2-3- مايع مني51
مايع مني حاوي اسپرم‌ها و ترشحات مايع غدد ضميمه‌اي است. حجم مني و تعداد اسپرم‌ها در گونه‌هاي مختلف گاو با هم متفاوت است. اما اغلب گاوها در هر بار انزالشان حدود 3 تا 5 ميلي ليتر مايع مني دارند که تعداد يک بيليون اسپرم در هر ميلي‌ليتر52 آن وجود دارد.
اگر اسپرم‌ها مدت زمان زيادي مصرف نشوند يا به عبارتي دام لقاح نکند و فعاليت جنسي نداشته باشد،اولين انزال‌ها يا اصلاً اسپرم ندارند،تعداد کمي اسپرم دارند،اسپرم‌ها قدرت حرکت ضعيف دارند،تعداد زيادي از اسپرم‌ها غير طبيعي هستند،اسپرم‌هاي مرده و يا فاسدشدني زياد وجود دارد. بنابراين براي ارزيابي و سنجش اسپرم‌هاي يک گاو بايستي چندين بار انزال تکرار شود و به بار اول نبايد قانع بود[42].
1-3- نسبت جنسي53
1-3-1- مقدمه
همانطور که مي‌دانيم در غالب جانداران،وجود دو جنس نر و ماده زمينه را براي توليدمثل جنسي و در نتيجه تداوم نسل فراهم کرده است. زندگي با آميزش دو سلول جنسي نر و ماده آغاز مي‌گردد. هر کدام از دو سلول جنسي نيمي از کروموزوم يا عوامل وراثتي (نيمي از اطلاعات) يک جاندار کامل را در خود جاي داده‌اند. با آميزش دو سلول جنسي اسپرماتوزوآ54 و تخمک55، ايجاد فرزندان يا مواليد مي‌شود که جانداران مکملي هستند. ترکيب دو سلول هاپلوئيد (n کروموزومي) ايجاد سلول ديپلوئيد (2n کروموزومي) را مي‌کند. اين فرزندان نر يا ماده هستند[16].
در پستانداران جنس ماده دو کروموزوم جنسي مشابه (X و X) را در سلول‌هاي تخمک داراست اما در موجود نر دو کروموزوم جنسي متفاوت در سلول‌هاي اسپرم وجود دارد. (Y و X) که از نظر شکل و اندازه متفاوتند. در پستانداران،جاندار نر به جهت دارا بودن دو نوع کروموزوم جنسي،معين‌کننده جنسيت فرزند خواهد بود[27, 11, 10].
1-3-2- ژنتيک دام نر
گاو داراي 30 جفت کروموزوم است که 29 جفت غير جنسي و 1 جفت آن جنسي مي‌باشد (2n=60)، معمولاً 29 جفت غير جنسي‌ها از نوع آکروسانتريک56 هستند و کروموزوم جنسي x از نوع ساب متا سانتريک57 است اما کروموزوم جنسي Y بسته به گونه گاو متفاوت است مثلاً در گاوهاي بوس تاروس58 که گونه مورد بررسي در اين پايان‌نامه است،اين کروموزوم از نوع ساب متاسانتريک است[17].
1-3-3- تفاوت اسپرم‌هاي حاوي کروموزوم X و Y
بسته به اين که کدام‌يک از کروموزوم‌ها در اسپرم حضور داشته باشد،محتواي DNA،شارژ سطحي، تحرک و برخي خواص فيزيکي مثل وزن و دانسيته و … در اسپرم‌هاي حاويX با اسپرم‌هاي حاوي Y متفاوت خواهد بود[16].
1- محتواي DNA: کروموزوم‌هاي X‌ از کروموزوم Y بزرگتر است. کروموزوم X از نظر اندازه، نوع و ترتيب ژن در پستانداران بسيار حفاظت شده است اما کروموزوم Y با تغييرات زياد بيش از 1000 ژن خود را در طي تکامل از دست داده است و بسيار کوتاه شده است. حدود 4/3 – 8/2درصد ژن يا DNA کمتري در آن نسبت به کروموزوم جنسي X وجود دارد[39, 11].
هر يک ميليون سال 35 تا 60 ژن از کروموزوم Y محو شده است. علت اين امر مي‌تواند ساختار خاص کروموزوم Y و محل زندگي آن يعني بيضه‌ها باشد که منجر به افزايش احتمال جهش خواهد شد[5].از جمله ژن‌هايي که فقط روي کروموزوم X وجود دارد ولي کروموزوم Y آن را ندارد مي‌توان ژن PLP نام برد. (پروتئوليپيد پروتئين)59. از جمله ژن‌هايي که فقط روي کروموزوم Y وجود دارد ولي کروموزوم X آن را ندارد. مي‌توان SRY60 را نام برد[44، 30 ، 21].
برخي ژن‌ها هم مانند PAR61 روي هر دو کروموزوم حضور دارند[11].
2-شارژ سطحي: اسپرم حاوي کروموزوم x داراي بار الکتريکي مثبت مي‌باشد و در نتيجه به سمت بار الکتريکي منفي جذب مي‌شود اما در کروموزوم Y اين امر صادق نيست[39, 16].
3- تحرک: سرعت حرکت اسپرم حاوي کروموزوم Y نسبت به اسپرم حاوي کروموزوم x در مايع مني بيشتر است اما به دليل کوچک بودن،ظريف‌تر و شکننده‌تر



قیمت: تومان


دیدگاهتان را بنویسید